抗心律失常中药心速宁胶囊的离子通道靶向机 [复制链接]

1、英国牛津大学生理学、解剖学和遗传学系牛津英国

2、天津中医药大学天津现代中医药国家重点实验室天津中国

心速宁是一种中成药，它自年起用于治疗室性早搏（PVC）。最近一项对名患者完成的临床试验表明，心速宁对PVC的抑制率与I类抗心律失常药物美西律相似，心速宁为65.85%，美西律为63.10%。我们之前报道过心速宁延长心肌细胞的动作电位时程（APD），抑制心肌细胞的动作电位幅度（APA）。本文旨在揭示心速宁对调控APD和APA的离子通道的影响，这有助于解释心速宁的细胞电生理机制。我们的主要发现是：（1）在离体大鼠心电图中，在心速宁存在下，R波振幅显著降低，T波振幅显著增加；（2）心速宁以剂量依赖性方式阻断hNaV1.5通道，IC50为0.18±0.02g/L；和（3）心速宁剂量依赖性的抑制hERG通道，IC50为0.34±0.01g/L。综上所述，心速宁的临床抗心律失常疗效是基于其I类和III类抗心律失常特性，通过抑制hNaV1.5通道和hERG通道，进而产生了减小APA和延长APD的作用。

尽管有许多研究都是为了更好地了解心律失常，并寻找有效和安全的药物来治疗这种常见的心脏病，但由于疾病原因及其发展的多因素和动态性，所取得的进展并不鼓舞人心。在过去几十年中，靶向离子通道或细胞电生理特性的新药开发策略发展得很成熟，但由于抗心律失常药物的不良反应，本方案中发现的药物远不能令人满意。本研究旨在探讨临床上有效的多种草药制剂/多成分中成药心速宁的抗心律失常机制，以期揭示心速宁的细胞电生理特性，为临床应用心速宁治疗心律失常患者提供指导，同时也希望为临床应用心速宁治疗心律失常患者开辟一个研究领域即：多组分药物的抗心律失常作用。

心速宁是一种在中国获得专利和认证的中成药。自年以来，它已在中国用于治疗室性心律失常，尤其是由心脏缺血和病*性心肌炎引起的心律失常。心速宁由11种中草药组成：*连、半夏、茯苓、枳实、常山、莲子心、苦参、青蒿、人参、麦冬和甘草。

在上市之前做的药理学研究表明：心速宁能显著抑制化学试剂苦参碱、氯化钙、氯仿和氯仿诱导的心律失常。异丙肾上腺素在心肌缺血诱导的心律失常中，心速宁显著延缓了室性心律失常的发生，缩短了心律失常的时间。上市之前做的*理研究表明，心速宁不会引起血液和尿液的任何异常变化，应用心速宁不会在心脏、肝脏或肾脏引起任何*性反应。最近对名患者的临床研究表明，心速宁对PVC的抑制率与美西律相似，心速宁对PVC的抑制率为65.85%，美西律对PVC的抑制率为63.10%。一项早期临床研究报告称，与普罗帕酮相比，心速宁显著改善了心动过速相关疾病患者的整体症状（p0.05）。此外，由于心速宁被授权用于临床治疗心律失常，因此没有报告心速宁引起的不良反应。

随着补充和替代医学在PVCs患者治疗中的普及，中医药在中国和西方国家的应用越来越频繁。我国还有其他抗心律失常的中药，如稳心颗粒和参松养心胶囊。据报道，稳心颗粒具有心脏保护和抗心律失常特性，对离子通道有调节作用。如INa、INaL、Ito、ICaL和If。另一个著名的抗心律失常中药是参松养心胶囊.据报道，参松养心胶囊阻断了各种离子通道，如INa、ICaL、Ito和IK1。

我们之前的研究表明，在分离的原代心肌细胞上，心速宁可延长APD，表现出类似III类抗心律失常药物的特性。我们报道了心速宁对离体心脏心电图、hNaV1.5钠通道和hERG钾通道的影响，以说明电生理机制，进而解释心速宁如何在临床上发挥其抗心律失常作用。

医药化工

陕西摩美得制药有限公司（中国陕西）提供的心速宁是上述11种草药提取物的冷冻干燥粉末（补充材料中描述了详细的制备程序）。近年来，对心速宁的化学成分进行了研究，采用超高压液相色谱法结合线性离子阱静电轨道探针串联质谱法（UHPLC-LTQ-Orbitrap轨道探针），41种成分被确定为候选生物活性成分。所有其他化学品均从SigmaAldrich（英国多塞特郡Gillingham）购买，并按供应使用，除非另有说明。

使用的动物

雄性Sprague-Dawley大鼠（-g）用于离体心脏灌流实验。实验动物动物在温度22C±2C，湿度40%±5%的笼中饲养，在12小时的昼/夜循环下，接受标准饮食和按需饮水。所有实验均由天津中医药大学动物实验伦理委员会（TJAB-JY--）审查和批准，并根据天津中医药大学动物实验指南进行。

雄性Wistar大鼠，体重-克，用于原代心肌细胞分离，并按需给予标准实验室食物和水。所有调查均符合美国国家卫生研究院（NIH第85-23号出版物，年修订）、内*部年《动物操作指南（科学程序）法》（HMSO）和机构指南。牛津大学动物伦理审查委员会和内*部（项目许可证编号30/和30/）批准。

心电记录

在研究心速宁对离子通道的影响之前，我们进行了一组实验来测试心速宁对离体大鼠心脏心电图的影响。我们在大鼠心室肌细胞中选择了大鼠心室肌细胞APD延长EC50浓度（即心速宁~0.8g/L）的1/2作为实验浓度。SD大鼠用异氟烷麻醉，心脏切除后立即浸泡在冰冷的Krebs-Henseleit溶液（KH液）中。KH液含有以下物质（mMNaCl,4.7mMKCl,25.0mMNaHCO3,1.2mMKH2PO4,1.2mMMgSO4,11.1mM葡萄糖、2.0mM丙酮酸钠和1.8mMCaCl2）。立即将主动脉插管至Langendorff灌注装置，并用KH溶液逆行灌注。（36.5±1C，pH7.35–7.40）在恒流模式下。KH用95%的氧气和5%的二氧化碳混合气体平衡溶液，并将灌注速度调整为10–15ml/min，以保持压力在70到80mmHg之间。心脏在窦性心律下自发跳动。在全部可实验用的离体心脏中，平衡期结束后立即开始试验，以获得稳定心脏跳动和状态，实验的前15分钟记录作为空白对照。在对照期后，用对照KH溶液或心速宁测试溶液灌流平衡的心脏。对照组KH溶液连续灌注10分钟，心速宁组心脏灌注0.4g/L的心速宁，10分钟。上述实验用心速宁全部溶解于新鲜制备的kh溶液中，并在用药前用0.22μm过滤器过滤。最后，用KH溶液灌流心脏10分钟。以上实验全程记录R波振幅、T波振幅、QRS间期、QT间期和RR间期。

原代心肌细胞分离

用异氟烷麻醉Wistar大鼠后，立即将心脏快速切除，浸泡上述冷Krebs-Henseleit（KH）溶液中，在Langendorff装置上灌流15分钟，在37°C的标准KH缓冲液中通入%的氧气，然后换成低Ca2+KHB溶液（含.1mMNaCl、3.0mMKCl、20.0mMNaHCO3，0.01mMCaCl2，1.0mMKH2PO4，1.2mMMgSO4，10mM葡萄糖，5.0mM丙酮酸钠，10.0mM牛磺酸和5.0mM甘露醇，pH7.4），持续10分钟停止心跳。然后用含0.08mg/mlLiberaseTh（RocheLifeScience）的低Ca2+KHB循环溶液在37℃消化心脏50分钟，将心室切碎，用4层纱布过滤到50ml离心管中，50g离心两次2分钟，用低Ca2+KHB溶液重悬。

全细胞膜片钳记录

采用膜片钳技术的电流钳模式记录大鼠心室心肌细胞的动作电位。室温下用细胞外液灌流心肌细胞（~22-24C），细胞外液成分（以mM为单位）：NaCl，；NaH2PO4，1；NaHCO3，24；KCl，5.4；MgCl2，1.2；CaCl2，1.8；葡萄糖，10；HEPES，5；pH值7.4。将端部电阻为2～5mΩ的硼硅酸盐玻璃电极（英国哈佛仪器）充灌含有（单位：mm）KCl，；MgCl2，2；CaCl2，1；Na2Atp，3；EGTA，11；和HEPES10的电极内液，pH值7.3。通过AxopatchTMB放大器中内置的数字脉冲发生器，通过施加幅度为动作电位阈值2倍的细胞内去极化刺激来刺激心肌细胞。使用膜片钳技术的电压钳模式，从稳定转染的人NaV1.5或hERG通道中记录NaV1.5和hERG电流。INa刺激方案为?转至20mV，持续50ms，增量为5mV，频率1Hz。使用AxopatchTMB放大器（美国加利福尼亚州森尼维尔市分子设备有限责任公司）以全细胞记录模式记录跨膜离子电流和电位，并使用PCLAMP10.3软件（AxonInstruments，Inc.）和Origin9.1分析数据。

统计分析

数据值表示为平均值±标准误差，并使用双尾配对t检验分析单个明显差异。用p0.05表示有统计学差异，用p0.01表示有高度统计学差异。

结论

心速宁对离体大鼠心脏心电图的影响

在研究心速宁对离子通道的影响之前，我们进行了一组实验，以测试心速宁对高浓度大鼠离体心脏心电图的影响，以期达到最大的效果。与对照组相比，0.4g/L心速宁可引起心电图形态的显著变化，包括R波振幅降低和T波振幅增加（图1和表1）。在心速宁灌流中和洗脱心速宁10分钟后，QRS间期、QT间期和RR间期均无明显变化。

心速宁对大鼠原代心肌细胞峰Na+电流的影响

在0.4g/L心速宁存在下，观察心速宁对大鼠心室肌细胞峰Na+电流的抑制作用。如图2所示，心速宁显著抑制了峰值Na+电流，这与抑制动作电位振幅相对应。

心速宁对人hNaV1.5通道的影响

心速宁对hNaV1.5通道的抑制作用如图3a所示。心速宁对hNaV1.5通道的抑制作用呈剂量依赖性，心速宁浓度范围在0.到1.6g/L之间，IC50为0.18±0.02g/L（图3b）。结合态分析表明，心速宁可能具有阻断失活态Na通道的作用。如图3c-e所示，稳态激活曲线中的V1/2从?39.29±1.41mV（对照，n=8）移动到?39.90±1.49mV（0.8g/l心速宁，n=8，p0.05v.s对照）。稳态失活曲线中的v1/2从?70.96±0.68mV（对照，n=8）转变为?75.20±0.63mV（0.8g/L心速宁，n=8，p0.v.s.对照）。稳态恢复曲线中的tau从4.92±1.24ms（对照组，n=6）移动到3.80±0.72ms（0.8g/l心速宁，n=8，p0.05v.s对照组）。

与对照相比，1赫兹（p0.）和10赫兹（p0.）时，0.8g/L心速宁均可产生显著地使用依赖性阻滞，当使用1.6克/升心速宁（p0.）时，这一现象更加明显。

心速宁对人血钾通道的影响

心速宁（0.4g/l）对hERG通道的影响如图5a所示。心速宁剂量依赖性地阻断了hERG通道，IC50=0.34±0.01g/L（图5b）。稳态抑制实验表明，心速宁可能在开放和失活状态下都有阻断hERG通道的趋势，如图5C、D所示，稳态激活曲线中的V1/2从?1.27±0.28mV（控制，n=8）平移到?23.79±2.31mV（0.4g/l心速宁，n=8，p0.v.s.对照）。稳态失活曲线中的V1/2从?59.87±0.81mV（对照，n=8）变为?97.56±2.25mV（0.4g/L心速宁，n=8，p0.v.s.对照）。

讨论

心速宁是我国临床证明的抗心律失常药物。在我国广泛应用10多年，未见严重不良反应的报道。适用于减轻冠心病和病*性心肌炎引起的室性早搏。年，《柳叶刀》报道了例患者的临床试验。结果表明，平均减量心速宁对PVC的影响（.67±.07）接近于美西律（.86±.70），明显高于安慰剂组（.47±.14）。与10多年临床应用相一致，本次临床研究未见心速宁的致心律失常现象。此外，XSN已经据报道治疗阵发性房颤和病*性心肌炎。我们先前的细胞电生理研究表明，心速宁通过延长心肌细胞的APD，显示出III类抗心律失常药物的特性。在本研究中，我们发现心速宁阻断了hNaV1.5钠通道和hERG钾通道，将心速宁作为I类和III类抗心律失常药物，类似于广泛使用的抗心律失常药物胺碘酮。NaV1.5通道的失活态阻断表明可能产生复极后不不应期，这也能够解释心速宁抑制早搏的机制。此外，0.8g/LXSN在两个测试频率下引起了显著的使用依赖性阻断（图4）：1赫兹（P0.）和10赫兹（P0.），这有助于解释心速宁对心动过速。阻断hERG钾通道，从而延长APD，增加心脏的有效不应期，进而抑制PVC。

PVC是一种相对常见的发生率，由心室中的异位起搏引起，其导致相当大的发病率和死亡率。它可能导致血流动力学恶化和可逆性左心室功能障碍，并可作为其他心脏病（如心肌病和缺血性心脏病）的电生理标志物。已经证明，频繁的PVCs运动试验的定量额外死亡率风险与缺血相似。PVCs的临床表现可能非常多变，从心电图（ECG）的偶然发现到充血性心力衰竭。对于有可能归因于PVC症状的患者。β受体阻滞剂或I类或III类抗心律失常药的药物治疗是有效的和推荐的。

心速宁作为一种多组分药物，对PVC、缺血诱导的心律失常和病*性心肌炎均有抑制作用，具有广泛的药理作用。众所周知，心律失常往往是由其他潜在的心脏疾病引起的，因此它是一种多因素疾病，需要多成分药物治疗。心速宁具有I、III类抗心律失常特性，但未在高浓度下诱发心律失常，本研究旨在进一步探索心速宁中的多组分如何协同调控以达到治疗效果而不引起不良反应。

结论

我们的研究结果进一步证明，复方中药抗心律失常药物心速宁具有明确的细胞电生理机制，这种电生理作用可以解释心速宁在治疗PVC患者中的临床疗效。心速宁的抗心律失常作用为多组分铲生的总体效果，因此也表现出了多种抗心律失常化学药物的特性。因此，我们得出结论：（1）心速宁具有是I类和III类抗心律失常药特征的多组分药物；（2）心速宁的剂量依赖性和完全可逆的作用表明心速宁具有低*性；（3）在减小APA和延长APD延长的基础上，发现其产生原因是心速宁阻断hNaV1.5和hERG通道。上述药理作用也解释了心速宁治疗PVC和快速心律失常临床疗效的生理机制。

研究局限性

尽管我们的研究结果明确地将心速宁定性为I类和III类抗心律失常药物组，但本报告缺乏心速宁在动物心律失常模型中的作用。由于有强有力的证据表明，心速宁是治疗PVC和缺血诱导的心律失常的临床有效的抗心律失常药物，如果我们研究心速宁在动物缺血和心律失常模型中的作用，将增加有价值的实验室研究数据。我们的下一步目标是通过在体实验以证明心速宁的抗心律失常作用。

作者贡献

Y-IM构思并设计了实验。TW、WX和JY进行了实验。TW和Y-LM分析了数据。YZ和Y-LM贡献了试剂、材料和分析工具。tw和y-lm写了这篇论文。CE和RW讨论了实验设计。

资金

这项工作得到了陕西摩美得制药有限公司在牛津大学资助的资金AVR00。

致谢

我们感谢YZ提供稳定的转染细胞系，感谢CarolynCarr教授提供刺激性讨论、设备和实验室空间支持。