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hiPSC分化的心脏细胞可产生的外泌体, [复制链接]

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17级的学弟们到了选择专业的时候了!因此我写了这样几篇推文(预期是5篇,加上今天2篇,已经发了4篇了),简单介绍几个心内科的研究热点,希望能吸引更多的学弟投身心内(对没错,就是这么直接)。

今天分享的是如上这篇文章。文章提到人类诱导的多能干细胞(hiPSCs)是一种很有前途的心肌细胞(CMs)、平滑肌细胞(SMCs)和内皮细胞(ECs)的来源,可用于心肌再生治疗。由于:①细胞保留率和植入率较低,②对这些细胞在肿瘤发生和室性心律失常中的潜在作用的担忧,③以细胞为基础的产品也比传统的治疗剂更难储存和运输,这项技术的临床应用一直受到限制,研究人员把目光投向外泌体。比如,由悬浮在水凝胶中的人诱导多能干细胞来源的心脏细胞(hiPSC-CMs)外泌体组成的贴片应用于梗死大鼠心脏表面,可以改善心功能、梗死面积、肥厚、CMs凋亡和心律失常。来自不同类型的hiPSC衍生的心肌细胞的外泌体的保护和再生特性是否不同还有待确定,特别是在大型动物的实验。

可能读正文部分比较枯燥,不过还是推荐读一下“总结讨论”部分(序号为04),了解目前该领域的一些研究展望。此外,最后还附上了外泌体染色方法整理。

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作者首先对所需用到的材料的特征进行了鉴定

(一)hiPSC衍生细胞的特征。

(1)hiPSCs被重编程以表达GFP。分化开始后第8天出现典型的收缩,收缩细胞数在第12天达到高峰。

(2)hiPSC-CMs标志物:α-肌节肌动蛋白、cTnT、cTnI。还检测到20%~30%的hiPSC-CMs表达心室肌球蛋白轻链2(仅存在于心室CMS中),相邻细胞间普遍存在缝隙连接蛋白Cx43。

(3)hiPSC-ECs的标志物:CD31、血管内皮钙粘素和血管性血友病因子(即vWF)。

(4)hiPSC-SMCs的标志物:α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Calponin1和肌球蛋白重链11(MYH11)。

(5)流式细胞术检测了上述2~4的标志物(cTnI、CD31、MYH11),鉴定了细胞纯度。

(二)hiPSC衍生细胞外泌体的特征。

作者按2:1:1比例的hiPSC-CMs:hiPSC-ECs:hiPSC-SMCs培养液经离心超滤和聚乙二醇沉淀,获取外泌体。之所以选择这一比例,是因为作者之前的研究表明含有2:1:1比例的这三种细胞的人心肌贴片(hCMP)可以促进猪心肌损伤的恢复,并且从hCMP培养液中收集的外体可以促进培养的CMs的细胞周期活性、增殖和对缺氧诱导的细胞*性的抵抗力,以及培养的ECs的血管生成活性。

(1)形态与结构。纳米颗粒追踪技术和透射电子显微镜观察直径为~98nm,具有双层膜的结构。

(2)表面蛋白/标志物。蛋白质阵列检测证实存在外泌体特异性标记(ALG-2相互作用蛋白X、肿瘤易感基因蛋白、CD81、CD63、Flotillin-1、细胞间粘附分子、内皮细胞粘附分子和膜联蛋白A5),并且不存在细胞膜蛋白GM。

(3)被细胞摄取能力。用PKH26标记的外泌体培养hiPSC-CMs,荧光成像证实被细胞摄取。当hPSC-CMs与绿色荧光染料PKH67标记的外切体一起培养,并用碘化丙啶(PI)染色以清除死亡细胞时,流式细胞术分析证实98%以上的活细胞也呈PKH67荧光阳性。

(三)外泌体miR序列特征。

用生物分析仪分析分别从各细胞及混合细胞的外泌体中提取的总RNA,并在IlluminaHiSeq上测定miRNAs的序列(关于此测序技术,

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